即用型工作菌株與新鮮菌液的區別

新鮮菌液或者新鮮培養物一般指處于對數生長(cháng)期的菌體（細菌培養18-24h，真菌2-3天，黑曲霉為孢子），處于對數生長(cháng)期的菌的活力和特性普遍認為是*。

即用型菌株采用凍干工藝制備而成，在此過(guò)程中不可避免會(huì )對微生物造成某種程度的損傷，同時(shí)低溫保存過(guò)程使微生物處于休眠狀態(tài)，生理活動(dòng)受到抑制，故其較新鮮培養物顯然是不同的。

既然兩者并不相同，那具體該如何應用？對比效果如何或者各自具備哪些優(yōu)勢呢？

1.在各應用中的情況

在微生物檢驗工作領(lǐng)域中，標準菌種主要應用于以下幾方面：培養基適用性、方法適用性和陽(yáng)性對照等。培養基的質(zhì)量水平通過(guò)菌株的生長(cháng)情況表征；檢驗方法適用性通過(guò)加菌回收確定，本質(zhì)上講也與菌株的生長(cháng)情況相關(guān)。不妨談一談兩者的可培養性。

2.1 培養基適用性

理論上，根據即用型工作菌株制備過(guò)程而言，冷凍干燥工藝不可避免會(huì )對菌株造成損傷。菌株的受損傷狀態(tài)是否影響其可培養性？已有學(xué)者選取2種即用型工作菌株與新鮮菌液在3種質(zhì)量情況不同的TSA上進(jìn)行比較各自的生長(cháng)情況。結果表明即用型ａ的活性與新鮮菌液的活性相當，而即用型ｗ的活性與新鮮菌液有顯著(zhù)性差異。同時(shí)也比較了3種TSA的質(zhì)量情況，盡管3者均能夠滿(mǎn)足藥典關(guān)于促生長(cháng)能力的要求[1]，但從實(shí)驗結果也不難看出，使用即用型ｗ菌株測定下B、N、H質(zhì)量差異要大于使用即用型ａ與新鮮菌液測定的質(zhì)量差異。iii 

圖例中：B、N、H為不同的TSA培養基；w、a為市售的即用型菌株；f為新鮮菌液。

值得一提的是文中所選用的菌株為銅綠假單胞菌，適合在水活度較高的環(huán)境中生長(cháng)，其對冷凍干燥的工藝要求更為苛刻。雖然文中僅比較了2種市售即用型菌株的1株菌與新鮮菌液的區別，但提示我們在可培養性方面，即用型定量工作菌株能夠做到與新鮮菌液活性相當。

基于上述差異，即用型定量工作菌株的自身特性支持這類(lèi)菌株是可以在某些領(lǐng)域更合理的應用，例如用于培養基的篩選、靈敏度、培養基適用性檢查等，幫助微生物檢驗人員篩選更加優(yōu)質(zhì)的培養基。

延伸來(lái)講，樣品中殘留的微生物活性并不處于最佳狀態(tài)，即用型工作菌株可能更加接近樣品中實(shí)際微生物的狀態(tài)，即用型菌株篩選的培養基能更好的檢測出樣品中微生物的實(shí)際情況，降低假陰性發(fā)生的可能性。

2.2 方法適用性

即用型定量工作菌株還有一個(gè)比較廣泛的用途是用于方法適用性試驗，有學(xué)者研究：采用5種定量標準菌株和新鮮菌液對8種藥品進(jìn)行需氧菌總數(TAMC)、霉菌和酵母菌總數(TYMC)方法適用性試驗，配對t檢驗，比較回收結果；發(fā)現兩種菌液回收結果差異無(wú)顯著(zhù)性差異(P＞0.05)，說(shuō)明即用型工作菌株可用于微生物限度方法適用性試驗[2]。

此外，在計數方法適用性驗證中，發(fā)現以下現象。例如：使用枯草芽孢桿菌的孢子及菌體進(jìn)行計數方法適用性驗證，結果存在差異；采用傾注法和涂布法進(jìn)行計數，出現結果不一致的情況。因藥典方法適用性中未就枯草芽孢桿菌的孢子進(jìn)行描述，也未查閱到該項的文獻依據，故其具體尚待研究。對于傾注法和涂布法兩種方法，有學(xué)者以飲用水源井為對象，采用涂布法與國標傾注法分別在營(yíng)養瓊脂進(jìn)行菌落計數實(shí)驗，結果發(fā)現涂布法得到的細菌總數量是傾注法的5倍～10倍（P=0.0020<0.05），且菌落大而分散便于計數 [3]。也有學(xué)者以金黃色葡萄球菌為對象，比較傾注法與涂布法接種培養菌數的差異，其結果顯示兩種培養方法，金黃色葡萄球菌的活菌數無(wú)差異[4]。以上兩方面研究一是采用實(shí)際樣品比較，二是采用標準菌株比較所得出的結論；對于本文所述“即用型工作菌株”使用不同方法檢測是否存在差異還未見(jiàn)報道。筆者認為此兩項涉及到培養體系的差異，培養體系不同，計數結果極有可能不相同。例如，同一菌株在非選擇性培養基和選擇性培養基存在計數差異，此差異也常見(jiàn)于新鮮培養物的計數中。

即用型定量工作菌株應用于方法適用性中，應根據實(shí)際情況采用ziu適合的接種方法。其開(kāi)展與新鮮菌液的比較試驗時(shí)，應保證培養體系一致。還需要注意的是，由于藥品的抑菌性、制劑類(lèi)型和狀態(tài)、建立檢驗方法的差異，可能會(huì )存在某些藥品在建立檢測方法時(shí)，使用定量菌株和新鮮菌懸液的結果可能存在差異，這就需要在建立方法的時(shí)候，綜合研究評估。

2.3 其他領(lǐng)域

即用型工作菌株除了直接使用外，其制備技術(shù)早已成熟運用到質(zhì)控樣品的研制中，例如：實(shí)驗室能力驗證、實(shí)驗室間的比對以及協(xié)作標定等領(lǐng)域。質(zhì)控樣品的研制多采用添加一定量的目標菌及背景菌，采用冷凍干燥技術(shù)制備而成，測試并評價(jià)質(zhì)控樣品的均勻性、儲藏穩定性和運輸穩定性，結果顯示研制的質(zhì)控樣品能夠滿(mǎn)足能力驗證的要求，且能力驗證可以真實(shí)的反應參試單位的檢測水平[5-7]。更有研究人員在儲藏穩定性、均一性和活力方面對制備的金黃色葡萄球菌質(zhì)控樣品進(jìn)行評價(jià)。得出以下結論：質(zhì)控菌株可以用于日常檢驗工作中的陽(yáng)性對照試驗和微生物限度檢查方法學(xué)適用性試驗，還可用于實(shí)驗室內質(zhì)量控制比對試驗[8]。

在抑菌效力檢查領(lǐng)域，其對于菌液的菌數含量要求約為108cfu/mL，此濃度范圍相對比較寬泛，采用新鮮培養物制備較為容易；而市售即用型工作菌株含量更為精準且一般菌含量不會(huì )太高，主要針對需要嚴格控制菌數的試驗領(lǐng)域。因此關(guān)于此領(lǐng)域中兩者對比，尚未見(jiàn)相關(guān)報道。預估其可能存在高估抑菌劑作用的風(fēng)險，推斷即用型工作菌株在制備生產(chǎn)過(guò)程中可能處于受損狀態(tài)，受損程度可能會(huì )疊加于效力檢測結果中，最終可能高估抑菌劑作用。

需要說(shuō)明的是，即用型工作菌株的質(zhì)量關(guān)鍵取決于凍干保護劑和凍干工藝，以及后續的儲存條件和運輸因素等。無(wú)論即用型工作菌株如何運用，其活性、均一性和儲藏穩定性均對最終的結果起著(zhù)至關(guān)重要的作用。

3.小結

市售即用型工作菌株存在差異；

即用型工作菌株，在可培養性方面，能夠做到與新鮮培養物無(wú)差異；

“活性”良好、均一穩定的即用型定量工作菌株作為質(zhì)控菌株可用于特定的用途；

使用過(guò)程中，應注意方法的選擇和實(shí)驗測試。

正如開(kāi)題所講，即用型菌株不能*替代新鮮培養物，同時(shí)，即用型菌株基于自身特性而具有的優(yōu)勢新鮮培養物也難以取代。與其爭論即用型菌株能不能使用，不如實(shí)事求是，用試驗數據說(shuō)話(huà)，完善質(zhì)量控制體系，做好風(fēng)險和管理的綜合評估。