如何選擇合適的培養基

MEM細胞培養基

細胞培養是實(shí)驗室里常見(jiàn)和基本的實(shí)驗了，但卻不是簡(jiǎn)單的。別小看細胞培養，這里可蘊含著(zhù)大學(xué)問(wèn)。有時(shí)候細胞狀態(tài)不好，轉染 、藥篩這些實(shí)驗根本就沒(méi)辦法做。影響細胞培養的因素很多，讓我們先從培養基和血清說(shuō)起。

經(jīng)典的培養基有很多種，Invitrogen (GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是應用廣泛的培養基。其他如M199、IMDM、L15培養基等也用于某些細胞的培養。

◆ MEM是由Eagle’s基礎培養基(BME)發(fā)展而來(lái)的，其中增加了組分的范圍及濃度。

◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM )培養基是為小鼠成纖維細胞設計的，現在常用于貼壁細胞的培養。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是MEM的4倍，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩沖作用。初的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L，后來(lái)為了某些細胞的生長(cháng)需要，將葡萄糖含量又調整為4500 mg/L，這就是大家常說(shuō)的低糖和高糖了。

◆ aMEM含有附加的氨基酸、維生素以及核苷和脂肪酸，它可廣泛應用于各種細胞類(lèi)型，包括對營(yíng)養成分要求苛刻的細胞。

◆ Ham’s F12是為在低血清濃度下克隆CHO細胞而設計的，現在也廣泛應用于克隆形成率的分析及原代培養。F12還可以與DMEM 等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結合的產(chǎn)物，這種培養基已應用于許多原代培養及更難養的細胞系的培養。

◆ RPMI 1640培養基是專(zhuān)為淋巴細胞培養 而設計的，現在已廣泛應用于懸浮細胞的培養。

以前經(jīng)常聽(tīng)到有人問(wèn)，這種細胞該用哪一種培養基呢?其實(shí)這個(gè)問(wèn)題的答案可以很簡(jiǎn)單，也可以好復雜。此話(huà)怎講?如果這種細胞是購自ATCC或其他的細胞庫，那很簡(jiǎn)單，問(wèn)供應商就行了?；蛘哒业较嚓P(guān)的文獻，作為參考。Invitrogen網(wǎng)站上有一個(gè)Cell Line Database的工具，也很好用。選擇你感興趣的細胞類(lèi)型，它就會(huì )彈出推薦的培養基、血清和轉染試劑等，有時(shí)還有優(yōu)化好的轉染步驟，很方便。Sigma網(wǎng)站上也有一個(gè)Media Expert，包括了培養基所有成分的功能描述、使用推介和參考文獻等，它還是一個(gè)解決問(wèn)題能手，對于細胞培養中的常見(jiàn)問(wèn)題，如細胞貼壁不好、培養基變色等，它都會(huì )列出可能的原因，并提供補救辦法。這個(gè)Expert果然不簡(jiǎn)單!

但如果你是著(zhù)手建立一種全新細胞的培養體系，根本找不到任何參考，那你就得花點(diǎn)時(shí)間自己試驗了。萬(wàn)事開(kāi)頭難嘛。因為沒(méi)有一個(gè)標準答案。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長(cháng)?？傊?，MEM做貼壁細胞培養、RPMI 1640做懸浮細胞培養會(huì )是一個(gè)好的開(kāi)始。你也可以購買(mǎi)幾種培養基來(lái)，然后花大約兩周的時(shí)間做一個(gè)簡(jiǎn)單的細胞生長(cháng)實(shí)驗，來(lái)選擇其中適合的。有時(shí)候你會(huì )驚訝地發(fā)現你的比較不錯的培養條件與文獻報道的不同，就算是同一種培養條件，細胞的生長(cháng)狀態(tài)也時(shí)好時(shí)壞，這是很正常的。因為試劑、水、不同批號的血清之間都存在著(zhù)差異。要提高培養基的穩定性，可以從培養基和血清兩方面入手。

以前大部分實(shí)驗室都是用干粉培養基，但配制過(guò)程就較為繁瑣，要溶解、調pH值，過(guò)濾，過(guò)程中可能會(huì )產(chǎn)生一些濃度誤差，而且有些實(shí)驗室的水質(zhì)并不理想，所以培養的效果會(huì )有差異。如果使用液體培養基，這種人為的誤差會(huì )減少，因為畢竟是大批量工業(yè)化生產(chǎn)的，批間差會(huì )很小。大家是不是感覺(jué)液體培養基會(huì )貴很多，以前是這樣，但現在非也。HyClone和Invitrogen都在國內建立了液體培養基的生產(chǎn)基地，生產(chǎn)和運輸成本大幅降低，所以現在的價(jià)格也只是50-60元/500ml，比干粉培養基貴不了多少，而且還幫你省了過(guò)濾器和時(shí)間。

血清含有生長(cháng)因子可促進(jìn)細胞的繁殖，含有附著(zhù)因子可促進(jìn)細胞的貼壁，同時(shí)還具有抗胰酶活性。血清同時(shí)也是礦物質(zhì)、脂類(lèi)及激素的來(lái)源。常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時(shí)間的早晚來(lái)分類(lèi)的。采血時(shí)間越早，營(yíng)養物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細胞系和克隆化培養。由于瘋牛病的原因，到目前為止，我國政府仍然禁止從北美洲、歐洲和日本等地區進(jìn)口牛血清，因此市面上的牛血清大多來(lái)自澳洲、南美洲，或是國產(chǎn)的。

而血清批次間的差別就是不可避免的，這種差異來(lái)源于不同的制備方法和除菌方法、動(dòng)物的年齡差別及血清的儲存條件等，而且與取血動(dòng)物的來(lái)源關(guān)系密切。不同的牧場(chǎng)、不同的氣候天氣及其他環(huán)境因素都可能影響血清的質(zhì)量。因此選好了一種血清就要盡可能長(cháng)期使用它。在需要更換時(shí)，也要盡量保持與原有的一批血清相似?，F在很多公司都提供血清預留，你一旦選定了某個(gè)批次的血清，可以備足一年的量，這樣可以避免很多麻煩。

血清固然是細胞培養中*的成分，但正如上文所說(shuō)，血清的批間差異大，更換血清時(shí)需要做大量的測試以取保替換的血清與原來(lái)的相似。而血清的供應也是必須要考慮的因素。由于氣候或瘋牛病的影響，說(shuō)不定哪天血清就突然沒(méi)得賣(mài)了，那對實(shí)驗的影響可非同小可。另外，血清的價(jià)格也很昂貴，雖說(shuō)現在也有便宜的國產(chǎn)血清，但是高品質(zhì)的澳洲血清價(jià)格仍舊高企。因此，也有一些實(shí)驗室開(kāi)始換用無(wú)血清培養基。

無(wú)血清培養基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顧名思義，就是在細胞培養中不需要添加血清，但是在某些應用中可能要添加生長(cháng)因子或細胞因子。無(wú)血清培養基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生長(cháng)因子、必需的營(yíng)養物質(zhì)和激素等，能減少上述血清帶來(lái)的不利因素，使細胞培養的條件更穩定。但它也不是沒(méi)有意思缺陷的的，從有血清培養過(guò)渡到無(wú)血清培養的條件并不像想象中那么直截了當。處于發(fā)育的不同分化階段的細胞(例如干細胞與定向前體細胞相比)需要不同的配方，對生長(cháng)因子和細胞因子的選擇尤為重要。而且在去除血清的同時(shí)，也去除了一些血清蛋白具有的保護、解毒作用，因此對試劑、水的純度和儀器清潔度的要求更高。另外，它的價(jià)格也比普通的培養基貴很多。

現在有很多廠(chǎng)家生產(chǎn)無(wú)血清培養基。GIBCO這個(gè)細胞培養的金字招牌當然少不了，它也是早研制無(wú)血清培養基的。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了ES細胞、雜交瘤、CHO、293、昆蟲(chóng)細胞、神經(jīng)細胞、淋巴細胞、角質(zhì)細胞、內皮細胞等多種細胞的無(wú)血清培養基。上個(gè)月還推出了間充質(zhì)干細胞的無(wú)血清培養基，能使MSC維持未分化狀態(tài)超過(guò)9代。HyClone公司也有CHO、293、雜交瘤細胞、昆蟲(chóng)細胞、病毒疫苗細胞的多種無(wú)血清培養基。Sigma則剛剛收購了澳大利亞JRH公司，有了JRH的EX-CELL系列，無(wú)血清培養基的選擇也更多了。

這么多種，要選擇起來(lái)也是個(gè)頭疼的事情。除了部分培養基是公開(kāi)配方的，如用于培養內皮細胞的MCDB 131(Sigma)，大部分液體培養基都是配方的，也就是說(shuō)其中的成分是保密的。那么你只能是檢索文獻、讓供應商推薦，然后用自己的細胞做幾次傳代培養來(lái)選出合適的培養基。畢竟實(shí)踐出真知嘛。

P.S.附上一些細胞培養中的小Tip，可能會(huì )對您有所啟發(fā)。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)

? 切記，細胞培養基的儲存條件是2-8攝氏度。如果細胞培養基不小心被凍，您應該融化培養基并觀(guān)察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，培養基可以正常使用，如果出現沉淀，只能丟棄這些培養基。

? 貯存在冰箱中的瓶口已開(kāi)的培養基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周?chē)腃O2水平時(shí)，碳酸氫納導致了pH值的上升。您可以在使用前松開(kāi)瓶口，在CO2培養箱孵育培養基10-15分鐘，來(lái)校正溶液的pH值(確定松開(kāi)瓶口以保證氣體交換)。

? 當在無(wú)血清培養基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì )結合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養條件下，抗生素不被滅活，可能對于細胞達到毒性水平。

? 一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開(kāi)始降解。

? 總之，大部分添加物和試劑多可以?xún)鋈?次，如果次數更多都會(huì )在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì )影響它的性能。

? 血清的熱滅活在免疫分析時(shí)可以滅活補體系統。在免疫學(xué)研究，培養ES細胞，昆蟲(chóng)細胞和平滑肌細胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。熱滅活是以往*的操作步驟，并沒(méi)有確鑿的證據說(shuō)明這樣做是有益的。相反，對大部分細胞而言，GIBCO和HyClone都不推薦熱滅活血清。因為加熱可能使血清中的沉淀增加，使您誤以為污染。

? 如何避免血清中沉淀物的產(chǎn)生?

1. 解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，實(shí)驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。并隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

2. 請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì )變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩定的成分也會(huì )因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

3. 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無(wú)須做此步驟。

4. 若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)久或搖晃不均勻，都會(huì )造成沉淀物的增多。

? 在進(jìn)行傳代培養時(shí)，我們強烈推薦進(jìn)行臺盼蘭活性記數。研究者常常通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的稀釋(1∶4或1∶2)進(jìn)行傳代，不進(jìn)行活性檢測，您可能接種比你認為的低的多的濃度的細胞，這常?？赡軐е律L(cháng)緩慢或培養物根本不生長(cháng)。

? 貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能開(kāi)始降解，如果在室溫下放置超過(guò)30分鐘，就會(huì )變得不穩定。

? 在訂購的細胞到達后，應立即復蘇，如果培養基還沒(méi)有準備好，可將其放入液氮中，盡快復蘇。千萬(wàn)不能放置在-20或-80℃的冰箱內。

? 細胞復蘇往往是比較容易出問(wèn)題的步驟。請在訂購細胞時(shí)就向供應商索取詳細的復蘇步驟，并仔細閱讀。有些供應商就不推薦在復蘇時(shí)離心，對此類(lèi)細節，應特別留意。