細胞培養注意事項

1. 實(shí)驗進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺風(fēng)扇運轉10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實(shí)驗完畢后，將實(shí)驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間隔應讓無(wú)菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細胞株之操作。2. 無(wú)菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺內。實(shí)驗操作應在抬面之中央無(wú)菌區域，勿在邊緣之非無(wú)菌區域操作。3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗。對于來(lái)自人類(lèi)或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無(wú)菌操作臺(至少Class II)。操作過(guò)程中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。5. 定期檢測下列項目：5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)。5.3. 無(wú)菌操作臺內之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線(xiàn)燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預濾網(wǎng)(300小時(shí)/預濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

請問(wèn)工作濃度的胰酶是不是應保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是幾個(gè)小時(shí)就會(huì )失去活性？
平時(shí)放在-20度，分裝在50毫升螺口管，用時(shí)拿一管放4度用。

1. 認真按照操作規程進(jìn)行實(shí)驗，一般不大會(huì )導致污染，很多情況下是由于所用的試劑或培養基有污染而使實(shí)驗失敗，

2. 粉末培養基配制好后(加了血清)，一般在4度盡量不要超過(guò)1個(gè)月，如在-20度存放時(shí)間可長(cháng)一些，但好也不要超過(guò)3-4個(gè)月，可能對于永生化細胞株來(lái)說(shuō)要求不是太高，但我在過(guò)去的4年里一直是作原代細胞培養的，細胞嬌弱，經(jīng)驗表明放置時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。

3. 關(guān)于實(shí)驗用品的清洗與消毒，我的經(jīng)驗是：用過(guò)的玻璃器皿先在清水中浸泡30min以上，然后加少許清洗劑，以超聲波洗滌30min左右，(如無(wú)超聲波洗滌器可用軟毛刷輕輕刷洗干凈)，撈出晾干，再在鉻酸洗液中浸泡6-18h(或過(guò)夜)后，自來(lái)水清洗10-15遍，雙蒸水清洗3-4遍，晾干，高壓消毒后即可使用。

許多塑料制品也可以高壓消毒，例如培養瓶蓋，膠塞，吸頭等。不能用于高壓的一般均已制成一次性作用的商品了，當然如果money有限，如進(jìn)口的培養板、皿等，也可以重復使用1-2次，我當時(shí)使用方法是將其*清潔后，使用前在紫外燈下敞開(kāi)照射1-1.5h即可，我做過(guò)多次，沒(méi)有出現問(wèn)題。塑料培養瓶由于清洗消毒不便，不要重復使用，如一定要重復用，可用環(huán)氧乙烷等消毒，(消毒后一定要放置半年以上方可使用)
在光鏡下，上皮細胞通常呈“鋪路石”樣排布，細胞之間有拉絲現象（即距離較遠的細胞可以通過(guò)細長(cháng)的觸手相連），細胞有成片生長(cháng)的特性。而間質(zhì)細胞通常呈梭形，沒(méi)有有成片生長(cháng)的特性，細胞之間的聯(lián)系不緊密。但是細胞的形態(tài)特征會(huì )因為生長(cháng)條件的改變而改變，如HeLa細胞是上皮細胞，但是在酸性培養條件下會(huì )變?yōu)樗笮巍?/span>

上皮細胞之間都有特征性的緊密連接（橋粒）結構，因此可以通過(guò)觀(guān)察培養細胞的超微結構來(lái)判斷細胞的類(lèi)型，如果有緊密連接，就必然是上皮細胞。這是一錘定音的證據。注意不要把細胞消化下來(lái)做電鏡，要用細胞刮刮下來(lái)后做電鏡。 此外每一種上皮細胞都有其特征的細胞角蛋白的表達（cytokertin, CK）,可以查一下子宮內膜腺上皮細胞表達的CK分子，然后進(jìn)行免疫細胞化學(xué)的鑒定。

細胞在偏堿的情況下培養，耐受能力會(huì )逐漸下降，可能是產(chǎn)生脫壁現象的原因，后來(lái)我重新測了一下培養基，為7.5左右，我用滅菌的HCL調了一下，培養基顏色變成淡紅透亮，再次培養，發(fā)現細胞貼壁比較好了，搏動(dòng)效果也不錯，因此，我以后每次培養前都要重新調好PH值，我覺(jué)得很多因素是能影響PH值的

血清質(zhì)量不好，影響了細胞生長(cháng)。所以，我認為以后養細胞，用的血清濃度是每批次血清都摸一下，不一定要以參考文獻為準，畢竟國產(chǎn)的血清質(zhì)量差異比較大啊。

細胞無(wú)菌操作是關(guān)鍵，對于配制培養液時(shí)，有些人為了讓培養粉充分溶解，攪拌4小時(shí)或更長(cháng)時(shí)間。其實(shí)這*沒(méi)有必要，一般培養基的固體組分還是易溶于水的，攪拌的時(shí)間長(cháng)了會(huì )增加污染機會(huì )，雖然后來(lái)濾過(guò)除菌了，但細菌的代謝產(chǎn)物比如脂多糖誰(shuí)能夠把它濾掉？細菌的代謝是很快的，甚至在常溫下20min就可以繁殖一代，太可怕了。我的經(jīng)驗就是攪拌30min-60min就把它過(guò)濾。

另外關(guān)于培養基的pH問(wèn)題，一般按照說(shuō)明書(shū)操作，加入所說(shuō)的NaHCO3量，與預計的pH不會(huì )有什么距離，也就是說(shuō)基本上不用調pH，如果相差大，要考慮三蒸水的質(zhì)量是否有所下降，當然這時(shí)調pH也是不得已而為之。我配培養基時(shí)基本上不調pH，只是用試紙檢測一下pH，觀(guān)察一下培養基的顏色。

（1）東西一定要用自己的。既不要借別人的，也不要借給別人?？赡艽蠹矣X(jué)得比較自私。實(shí)際上還是很有好處的。并不是每個(gè)人的操作都規范，因此相互之間串著(zhù)用，很容易造成交污染。
（2）我習慣口對口倒液體，在倒前倒后都要在酒精燈上過(guò)一下。自己認為比起用吸管吸更能很好的防止污染。步驟越簡(jiǎn)單，越能防止污染。而且還能節省很多吸管。
（3）一次將所有的所需要試劑、工具放入工作臺。不要做到半路，又出工作間拿東西，這樣增加了污染的機會(huì )。
（4）整個(gè)操作要快、動(dòng)作要輕、而且不要干其他的事情。比如手機響了，應該不要接。我一般操作的時(shí)候將手機關(guān)了，手機聲音響起，好煩躁。
（5）我一般開(kāi)紫外線(xiàn)照射臺的時(shí)候，就將培養基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后，溫度也升上來(lái)了。有很多人將他放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛生，有的常年不清洗，里面很臟，容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用它的也一定要勤換水。從水域鍋那出后，找個(gè)毛巾插干上面的水。
（6）操作前要洗手，用75%酒精搽手。用完操作臺，要打掃衛生。
細胞要經(jīng)常凍存，我一般只要細胞狀態(tài)好就將細胞凍存起來(lái)。細胞狀態(tài)差了，扔掉，重新復蘇。這是一個(gè)必須養成的習慣。畢竟很多情況下，細胞并不是因為污染了，才讓你感到頭痛。這樣你不會(huì )擔心沒(méi)有種子了。我一般是不加雙抗的，只要注意，不會(huì )污染。

過(guò)濾時(shí)不要用槍吹細胞!! 如果用力吹,篩網(wǎng)就像刀片一樣,把你的細胞全部切碎!!

刷玻璃器皿的過(guò)程：初洗、泡酸（一天）、自來(lái)水沖洗（10遍）、純化水沖洗（3遍）、注射用水沖洗（3遍）。感覺(jué)過(guò)于苛刻，自來(lái)水只沖洗3遍。被老師發(fā)現后，一陣痛批，才知道這是極其關(guān)鍵的一步，殘留的酸可能會(huì )抑制細胞生長(cháng)，甚至導致細胞死亡，痛失辛苦得來(lái)的細胞，心血付之東流。無(wú)知不能無(wú)畏，一定不能大意。

做好準備工作。不要急于投身到細胞培養中去，要先設定計劃：步驟，工具，試劑。特別是將細胞用于大規模生產(chǎn)時(shí)，尤其如此。eg.經(jīng)過(guò)干熱滅菌的容器一般認為可以在一周內保持無(wú)菌狀態(tài)，如果準備多了，用不完的就得重新滅菌，耗費能源、占用滅菌空間，不值得；干熱滅菌需要一天的時(shí)間，當器皿準備不足時(shí)，只能干著(zhù)急，錯過(guò)了比較佳操作時(shí)間，也許得很久才能將細胞狀態(tài)再調整好。
對于驕氣的細胞，我一般都是天處理完后，加少量培基（夠蓋住瓶底部），第二天換液，以免死細胞和碎片對活的產(chǎn)生不良影響。新配的培養基直接用很清亮，但是在－20度保存一段時(shí)間后再溶解就要出現很多雜質(zhì)，用37度水孵育沒(méi)有效果，握在手里不停搖動(dòng)非常有效。其實(shí)對于操作熟練的人來(lái)說(shuō)，污染并不是我們想像那樣容易出現，園子里很多人都問(wèn)否污問(wèn)題，而培養基的PH值往往被忽略，而且大多數人都習慣于一次配制1升培養基，分裝成10X100ml，用1瓶，另外9瓶放在－20度保存，很容易出現結晶，鏡下看就是一些桿狀的物資，有時(shí)候晃動(dòng)培養基，肉眼就可以看到很多沉淀，這就需要我們在用之前好好搖勻了。

細胞凍存： 當細胞狀態(tài)好，或者代數比較早，一定要大量?jì)龃?，不要吝惜暫時(shí)的大批使用血清，當細胞狀態(tài)不好，長(cháng)不起來(lái)的時(shí)候，馬上取出來(lái)復蘇，省時(shí)省力，不要去嘗試努力恢復狀態(tài)不好的細胞，費時(shí)間也費血清，會(huì )令你痛苦不堪。另外凍存的細胞不要放到一個(gè)地方，－80度，液氮（甚至不同的液氮罐）都放一點(diǎn)，誰(shuí)也不敢保證不出意外，冰箱也可能有化的時(shí)候（我們－20度冰箱就化過(guò)），都放在一塊容易全軍覆沒(méi)。
按照試劑的保存標準保存，象血清、胰酶等沒(méi)開(kāi)封的-20℃，開(kāi)封后-4℃保存一般不超過(guò)7天（用完它吧，不然浪費了） 。

5.一定要弄清楚每個(gè)組分的作用，特點(diǎn)，比如NaHCO3容易分解，因此培養基在過(guò)濾除菌時(shí)pH會(huì )上升，一般是0.1-0.3，所以在過(guò)濾之前，要把培養基的pH調低0.1-0.3。如果你不了解NaHCO3容易分解的特點(diǎn)，就不會(huì )做相應的處理，那么培養基不符和要求，細胞就長(cháng)不好。 臺盼藍主要用來(lái)鑒定原代培養細胞時(shí),細胞分離后的存活情況，用0.4%臺盼藍直接染色5-10分鐘，在顯微鏡下觀(guān)察即可，活細胞不被染色。方便易用，因此在實(shí)驗室中比較常用，尤其在心肌細胞原代培養中。