流式實(shí)驗中的抗體滴定

一般我們購買(mǎi)商品化的primary antibody的時(shí)候，抗體的說(shuō)明書(shū)中都會(huì )給我們一個(gè)推薦的抗體使用濃度。這個(gè)濃度在一定程度上來(lái)說(shuō)，是過(guò)飽和的，可以滿(mǎn)足大多數實(shí)驗的染色需求。

但是因為是過(guò)飽和的濃度，這就帶來(lái)了一定程度的抗體浪費。而過(guò)量的抗體，也會(huì )大大提高樣本的自發(fā)熒光。

從另一個(gè)角度來(lái)看，因為廠(chǎng)家給出的推薦濃度都是基于一個(gè)特定的樣本濃度和樣本體積，所以在一些特殊的實(shí)驗中，比如樣本濃度或樣本體積過(guò)大的實(shí)驗，推薦的濃度就無(wú)法達到飽和滴加的要求。在這樣的前提下，推薦實(shí)驗用戶(hù)針對自己的實(shí)驗要求，zui好可以對抗體進(jìn)行滴定。節約成本的同時(shí)，也可以讓自己的實(shí)驗更加。

滴定的原則：

1. 在進(jìn)行滴定實(shí)驗前，應該遵守一個(gè)實(shí)驗一個(gè)變量的原則。既然滴定實(shí)驗要求的是摸索出準確的抗體工作濃度，那在制作樣本前，也需要對其他的實(shí)驗條件進(jìn)行統一。而這些在滴定實(shí)驗中的條件，也應該沿用到后續的正式實(shí)驗中去。

2. 需要統一的條件：樣本，樣本數量/管，樣本體積/管，孵育條件等?？偟膩?lái)說(shuō)，一個(gè)成功的滴定實(shí)驗，只應該有“抗體的終濃度不同”這一個(gè)實(shí)驗中的變量。

3. 滴定的稀釋倍數：一般按照5倍稀釋的標準做5個(gè)梯度的原則做滴定實(shí)驗。也可根據自己的實(shí)驗進(jìn)行適當調整。起點(diǎn)濃度的選擇則需要按照具體的實(shí)驗進(jìn)行分析。比如，對于PBMC或者裂解后的全血、脾臟之類(lèi)的樣本，活細胞比例高，單管樣本一般以1*10^6為上限?？梢詮耐扑]用量開(kāi)始，往下5倍稀釋?zhuān)?個(gè)梯度。但是有些原代細胞，比如涉及腫瘤免疫方面的樣本，活細胞比例低，免疫細胞的浸潤比例低，所以制備的樣本數量也會(huì )比較大，這個(gè)時(shí)候，也可以選擇超過(guò)推薦的濃度滴加，然后再進(jìn)行梯度稀釋。

4. 滴定實(shí)驗完成后，通過(guò)計算染色指數（stain Index）確定zui佳抗體濃度。染色指數公式如下：

示例：

我們以anti-human CD3抗體舉例：在100ul全血樣本中，我們以該抗體推薦的用量5ul/tube 為高濃度，5倍稀釋?zhuān)⒃O置5個(gè)梯度。高濃度至低濃度分別是5ul/100ul blood，1ul/100ul blood，0.2ul/100ul blood，0.04ul/100ul blood，0.008ul/100ul blood。通過(guò)計算，染色指數由高濃度到低分別為98.57，106.29，96.97，12.36，8.58。從染色指數上看，我們挑選出zui優(yōu)的抗體濃度為1ul/100ul blood。即為推薦用量的1/5。

用第三方軟件進(jìn)行數據疊加可以一目了然。

注意事項：

1. 對于一些陽(yáng)性表達幾乎100%的細胞，比如PBMC中的CD45,可以在樣本染色后少量加入未染色的細胞。

2. 對于表達量比較少的稀有細胞群體，在染色時(shí)，可加入該群細胞的父級細胞群的抗體。在設計多色實(shí)驗的滴定時(shí)，zui好可以分批滴定。將表達量高的抗體先進(jìn)行滴定。確定zui佳濃度后，再滴定表達量少的抗體，并將已經(jīng)滴定好的抗體一同加入。比如我們在滴定外周血中的foxp3時(shí)，zui好可以加入已經(jīng)確定好濃度的CD4抗體。

3. 對于消化的組織來(lái)說(shuō)，因為存在大量的死細胞，所以在這些樣本的滴定過(guò)程中，要先加入死活染料區分死活，再確定目標抗體的濃度。

4. 是否需要在滴定前blocking？取決于正式實(shí)驗。如果正式實(shí)驗是封閉的，那么滴定實(shí)驗也需要。

5. 遇到不同廠(chǎng)家，不同貨號，不同克隆號的抗體，需要重新滴定。

6. 滴定完成后，理論上只要cat號一致，lot號不一致，不需要重新滴定。但是為了保險起見(jiàn)，每一瓶抗體，特別是不同lot的抗體，zui好留一個(gè)樣本的抗體量，以方便日后的QC或者實(shí)驗復盤(pán)。