實(shí)驗新手系列：關(guān)于wb實(shí)驗

一、實(shí)驗過(guò)程中需要注意的問(wèn)題

①蛋白樣品的提取及蛋白含量的檢測

 蛋白樣品的提取咱們*是按照試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)做的，步驟沒(méi)有什么講的，但是因為蛋白樣品的好壞直接決定了是否能做出來(lái)蛋白條帶，這就好比蓋房子所需要的磚頭一樣，一定要務(wù)必認真。

②儀器準備

 清洗玻璃板：玻璃板的正確拿法應該是拿住玻璃板的左右兩側不要用手拿上下兩端，避免手套上面的臟東西順著(zhù)水流流到玻璃板上，玻璃板請一定務(wù)必清洗干凈，不干凈的玻璃板上面的殘留物可能會(huì )影響凝膠之間的化學(xué)反應，導致膠出現問(wèn)題，對后面的結果影響很大。

 玻璃板放置：玻璃板底部對齊，垂直放入夾子中間加緊，高的在后，矮的在前。

3凝膠配置

 根據蛋白分子量的大小選擇合適濃度的分離膠，可參考凝膠配置試劑盒中說(shuō)明書(shū)或者參考別人的文獻。配膠的APS需要在4度冰箱保存。注意配膠的時(shí)候膠一定一定要混勻，配膠的試劑中APS與TEMED是促凝劑，所以在加促凝劑之前先把其他組分混勻，可用*吹打也可用手腕去甩，向左甩n次再向右甩n次，或者用咱們實(shí)驗室的混勻的那個(gè)儀器混勻，名字我給忘了，那個(gè)效果好產(chǎn)生的氣泡很少而且節省人力。。。

④將配置好的分離膠沿著(zhù)玻璃板一側緩慢打入玻璃板中，這個(gè)時(shí)候不用擔心打入氣泡，灌入合適量的分離膠之后，加入適當劑量的ddWater或者異丙醇封膠（加入封膠試劑量沒(méi)有規定，蓋住整個(gè)分離膠膠面即可）

5上樣

A. marker孔加入5微升，其余蛋白孔上樣10微升左右，不要加的太多，這個(gè)后面會(huì )做說(shuō)明。

B. 電泳儀及轉膜儀請務(wù)必確定正負極是否對準確，不要犯低級錯誤。

⑥電泳

 這個(gè)沒(méi)有具體的時(shí)間限制，只要分子量小的蛋白跑到膠的底部即可。在電泳過(guò)程中是否需要進(jìn)行壓膠還是直接恒壓跑到底這個(gè)問(wèn)題后面說(shuō)明。電泳開(kāi)始的時(shí)候開(kāi)制冰機制冰，為后面的轉膜做準備。

⑦轉膜

A. 電泳快結束的時(shí)候就可以配置轉膜液（轉膜液室溫20-30度不宜放過(guò)長(cháng)時(shí)間，幾天內用可以室溫放置，如果時(shí)間太長(cháng)可放入4度冰箱保存）

B. 根據自己的蛋白位置選擇合適的位置切膠，切膠過(guò)程中保持膠的濕潤（用蒸餾水不定時(shí)潤濕），因為膠一旦干了脆性增強，很容易斷。

C. 根據膠的大小選擇合適大小的膜，膜和膠相同大小或者略小于膠，并且膠面和膜之間不能有氣泡，大多數人認為如果膜大于膠會(huì )使得轉膜過(guò)程中膠面短路，一是使得局部的蛋白不能轉到膜上去，二是短路會(huì )使得局部溫度過(guò)高（熱量=U2/R*t）凝膠受熱變形，轉到膜上的蛋白歪七扭八，但是丁香園里面有大神說(shuō)過(guò)氣泡對于轉膜影響不大，我沒(méi)試驗過(guò)。。

D. 膠，膜，濾紙，海綿放置成三明治結構，一旦放好不要亂動(dòng)，否則對齊的膠和膜之間位置會(huì )有偏移。

A. 選擇合適的轉膜時(shí)間進(jìn)行轉膜，至于轉膜是選擇橫流還是恒壓后面詳細贅述，整個(gè)轉膜過(guò)程，轉膜儀需放置在冰水混合物中進(jìn)行。

⑧抗原抗體反應

A. 麗春紅染色？？（是否需要麗春紅染色以及什么情況下需要麗春紅染色后面介紹）

B. 剪膜：根據自己的蛋白位置進(jìn)行剪切

C. 洗膜  5min/3次

D. 封閉  選擇適當的封閉液進(jìn)行封閉（脫脂奶粉或者牛血清白蛋白）封閉多長(cháng)時(shí)間？這個(gè)后面介紹

E. 一抗過(guò)夜孵育F. 洗膜  5min/3次

G. 二抗孵育 室溫一小時(shí)

H. 洗膜  5-10min/3次

⑨ECL發(fā)光成像

   ECL發(fā)光液A液與B液1：1混合，將發(fā)光液滴到膜上曝光觀(guān)察，若是對同一張膜進(jìn)行其他蛋白曝光處理，可用一抗二抗洗脫液洗脫后重新一抗二抗孵育處理，若是對同一蛋白進(jìn)行重新曝光則不需要。