PCR體系中引物占有十分重要的地位

在整個(gè)PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的的DNA結合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進(jìn)行有效的延伸，可見(jiàn)引物設計好壞與PCR結果密切相關(guān)。

一、PCR引物設計原則

1、引物長(cháng)度一般在15-30bp

引物長(cháng)度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應大于38bp，因為過(guò)長(cháng)會(huì )導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應；

2、引物GC含量一般為40%-60%

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應的模板序列的Tm值在72℃左右

Tm值在72℃左右可使復性條件*，至少要在55-80℃之間。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是鄰近法(the nearest neighbor method)；

4、引物3’端的堿基一般不用A

引物3’端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對比較高。

5、引物3’端出現3個(gè)以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會(huì )使錯誤引發(fā)機率增加。

6、引物3’端的互補、二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR反應失敗。

7、如擴增編碼區域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì )影響擴增特異性與效率；

8、引物5’端可以修飾

引物5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標記物。

9、堿基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個(gè)堿基的互補。

引物序列在模板內應當沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發(fā)。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會(huì )折疊成發(fā)夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會(huì )因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個(gè)堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3’端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross Dimer）的形成。引物之間不能有連續4個(gè)堿基的互補。引物二聚體及發(fā)夾結構如果不可避免的話(huà)，應盡量使其△G值不要過(guò)高（應小于4.5kcal/mol）。否則易導致引物二聚體帶的 產(chǎn)生，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進(jìn)行。

10、引物的ΔG值呈正弦曲線(xiàn)形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高。

ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，一般情況下，引物的ΔG值呈正弦曲線(xiàn)形狀，即3’端ΔG值較低，而5’端和中間ΔG值相對較高。3'端的ΔG值相對要低，且值不要超過(guò)9，引物的3’端的ΔG值過(guò)高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結構并引發(fā)DNA聚合反應。

11、引物應在核酸保守區內設計并具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續8個(gè)互補堿基同源。

二、Real Time PCR引物設計原則

Real Time PCR用引物與普通PCR引物設計要求不同。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進(jìn)行擴增，對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。