輕松看懂pcr實(shí)驗結果圖

辛辛苦苦提完 RNA，逆轉錄后一個(gè)個(gè)孔加完引物和模板，Z后進(jìn)行 RT-PCR，你以為這樣就可以美滋滋地坐等結果了？等到一幅下面這樣的結果圖，不知道對于剛接觸 RT-PCR 的你來(lái)說(shuō)內心是否是崩潰的？

這是啥？怎么看？

別急，讓我慢慢跟你介紹，看完后你就能準確的分析出你的 RT-PCR 結果了?！高@里以 7500 軟件為例進(jìn)行介紹」

1. 首先設置好內參和對照組「在 Analysis Settings 處」，一般我們在上機前會(huì )對應設置好的，如果設置好的話(huà)可以直接跳至第 3 點(diǎn)。如果沒(méi)有設置好的話(huà)是需要重新進(jìn)行設置。

2. 點(diǎn)擊進(jìn)去后，選擇對應好的內參和對照組?！冈?Relative Quantization Settings 選項下」

3.選擇好內參和對照組后，我們首先看看 PCR 跑的有沒(méi)有問(wèn)題，在這里大家Z常會(huì )見(jiàn)到的問(wèn)題是在樣品池出現了三角形符號，如下圖：

那么這些三角形代表什么意思？沒(méi)錯，聰明的你應該已經(jīng)想到是這個(gè)孔出現了問(wèn)題，而三角形中的數字是幾則代表了孔中有幾個(gè)問(wèn)題。具體又是什么問(wèn)題呢？我們就要通過(guò) analysis 中的 QC Summery 進(jìn)行查找。

舉個(gè)栗子，比如圖中的 A9 孔，出現了 2，則表示有 2 個(gè)問(wèn)題，第 1 個(gè)問(wèn)題如上圖所示，High standard deviation 高的標準偏差，表示可能是你上樣時(shí)導致的樣品復孔之間差異較大。第二個(gè)問(wèn)題則是下圖中，系統認定 A9 孔中的數值偏差較大，屬于異常值。

當然，還有比較常見(jiàn)的問(wèn)題是引物二聚體引起的雙重峰，如 A4 孔。

4. 溶解曲線(xiàn)「melt curve」：表示隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結構降解程度的曲線(xiàn)?？偟?DNA 雙螺旋結構降解一半的溫度稱(chēng)為熔解溫度「Tm」，不同序列的 DNA，Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高，Tm 值越高，成正比關(guān)系。正如上面提到的，正常的樣品孔溶解曲線(xiàn)應該是單峰的，如下圖。如果出現了雙峰，則要考慮是否引物設計不合理或者引物過(guò)量引起溶解曲線(xiàn)出現多峰的情況。

5. 如果前面的幾項都沒(méi)有太大的問(wèn)題的話(huà)。Z后我們看看Z重要的結果，也就是目的基因的變化情況了。在內參與對照組選擇沒(méi)錯的情況下，點(diǎn)擊 gene expression 選項，選中你想查看的樣品孔的基因表達情況。

好了，這次的 RT-PCR 看圖分析就到這里。Z后需要注意的是圖中的結果還需要輸出進(jìn)行后續的自行運算得出結果。圖中的結果只能給出參考。但大致趨勢是相同的，如果還有童鞋想聽(tīng)后續如何計算 RT-PCR 的結果及原理的話(huà)，歡迎關(guān)注下期的 RT-PCR 結果的計算原理與計算模板。