ELISA試劑盒初學(xué)者看結果

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以簡(jiǎn)單地回答樣本中有多少蛋白質(zhì)/多肽/抗體這一基本問(wèn)題，是實(shí)驗室比較常用的一種檢測方法。而這種簡(jiǎn)單的分析方法的核心，就是標準曲線(xiàn)。沒(méi)有它，我們的實(shí)驗就變成了一個(gè)二元的“是/不是”測試。有了它，我們可以深入研究生物反應的細節。那么，是什么使得標準曲線(xiàn)如此強大呢?讓我們在ELISA的背景來(lái)討論這個(gè)問(wèn)題。

簡(jiǎn)單地說(shuō)，標準品就是一系列已知目標蛋白數量的陽(yáng)性對照。例如，如果對人類(lèi)IgG進(jìn)行ELISA檢測，標準曲線(xiàn)將包含逐漸減少的已知量的人類(lèi)IgG，它會(huì )讓你立刻得出一系列的結論。

1.我的ELISA實(shí)驗有效嗎?

是否可以看到標準品的信號？如果可以，實(shí)驗是好的；如果沒(méi)有，就應該進(jìn)行故障排除。也許抗體問(wèn)題，或者系統中的其他東西沒(méi)有得到優(yōu)化。

2.我的ELISA檢測正常嗎?

這是一個(gè)比較棘手的問(wèn)題。當標準濃度下降時(shí)，信號是否減少？如果答案是肯定的，那
就是一個(gè)好的開(kāi)始。如果答案是否定的，可能在某些步驟引入了一些背景，或者移液管
可能需要校準。

3.是否在系統中引入了背景?

一組適當的標準品總是以空白結束，在空白孔中不存在標準品。如果空白孔OD值為>0.1，說(shuō)明可能引入了一些背景。

計算未知數

標準曲線(xiàn)的真正能量在于它能夠測定未知樣品的濃度。如果我們觀(guān)察IgG反應，我們可以將樣本的OD值與標準的OD值進(jìn)行比較，并根據相對OD值得出一些結論。例如，如果我們知道一個(gè)333 ng/mL的標準品OD值在2.1左右，而一個(gè)111 ng/mL的標準OD值在1.7左右，那么我們可以假設一個(gè)未知的OD值在1.9左右應該在200 ng/mL左右。直到我們把它畫(huà)在曲線(xiàn)上，然后得出一個(gè)方程。當我們檢測到更多的目標時(shí)，OD值上升，當我們檢測到更少的目標時(shí)，OD值下降。

那么，曲線(xiàn)一定是線(xiàn)性的嗎？這看起來(lái)不太對。坦白地說(shuō)，這和我們的眼睛告訴我們的并不相符。如果我們有1200ng /mL的濃度，OD值會(huì )是3嗎?當然不是。數據看起來(lái)接近一條水平漸近線(xiàn)——曲線(xiàn)不會(huì )通過(guò)這個(gè)值。所以不管濃度有多高，都不會(huì )超過(guò)2.5左右。類(lèi)似地，這條曲線(xiàn)似乎表明，如果濃度為負，可以生成OD值在0.5左右。

4.參數對數曲線(xiàn)

使用圖1的數據來(lái)擬合，得到如下s曲線(xiàn)。這條曲線(xiàn)非常清楚地顯示了水平漸近線(xiàn)，同時(shí)也顯示了標準濃度增加或減少時(shí)的良好的、與劑量相關(guān)的響應。

四參數方程的擬合函數表達式為：

在這個(gè)方程中，“a”和“d”分別表示可以得到的小值和大值——我們的漸近線(xiàn)。“c”表示拐點(diǎn)——曲線(xiàn)的中點(diǎn)，“b”表示曲線(xiàn)在“c”處的斜率。根據這個(gè)方程，我們現在可以反算出一個(gè)樣本的未知濃度。大多數ELISA閱讀器都可以自動(dòng)完成這項工作。

它不于競爭法, 夾心法也可以用它。它的形狀, 根據情況, 可能是一個(gè)單調上升的類(lèi)似指數, 對數, 或雙曲線(xiàn)的曲線(xiàn), 也可能是一個(gè)單調下降的上述曲線(xiàn), 還可以是一條 S 形曲線(xiàn)。 它要求 X 值不能小于 0 (因為指數是實(shí)數, 故有此要求)。 在很多情況下它都可以擬合 ELISA 的反應曲線(xiàn), 所以它也成了 ELISA 中應用廣的模型之一。

當使用4參數擬合曲線(xiàn)時(shí)，記住一些實(shí)用的技巧是有幫助的。由于以漸近線(xiàn)開(kāi)始和結束，曲線(xiàn)范圍之外的數據可能會(huì )產(chǎn)生不準確的結果。更進(jìn)一步說(shuō)，試著(zhù)在S中間標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內工作。一般來(lái)說(shuō)，未知計算在曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍內更準確?？梢韵♂尦鰳藴是€(xiàn)范圍的樣本，根據標準曲線(xiàn)計算濃度，然后根據初始稀釋值乘以相應倍數。